細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的原理、使用方法及注意事項(xiàng)

細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡是為維持環(huán)境穩(wěn)定，為更好的適應(yīng)勝春環(huán)境而主動(dòng)爭(zhēng)取的一種死亡過程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等作用，是一種字體損傷的現(xiàn)象。zui常用的目前就是細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒。

細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒原理

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的基本特征之一，在機(jī)體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等方面都起到十分重要的作用。Annexin V是一種分子量為35.8 KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與細(xì)胞凋亡過程中翻轉(zhuǎn)到膜外的磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）高親和力特異結(jié)合。FITC-Annexin V結(jié)合到凋亡細(xì)胞后，在藍(lán)色光的激發(fā)下，發(fā)出綠色熒光，區(qū)分出凋亡細(xì)胞與正常細(xì)胞。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）是一種核酸染料，它不能穿透完整細(xì)胞膜，但對(duì)凋亡晚期細(xì)胞和死細(xì)胞的破損細(xì)胞膜能夠穿透，并使細(xì)胞核紅染。將FITC-Annexin V與PI匹配使用，可以將凋亡早期的細(xì)胞和晚期的細(xì)胞區(qū)分開來。

細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒使用步驟

1. 調(diào)整待測(cè)細(xì)胞的濃度為5×105-1×106個(gè)/ml。 2. 取1ml細(xì)胞，1000rpm，4℃離心10分鐘，棄上清。 3. 加入1ml預(yù)冷的PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，1000rpm，4℃離心10分鐘，棄上清（對(duì)于貼壁細(xì)胞，先用胰酶消化，再用PBS洗滌）。 4. 重復(fù)步驟3兩次。 5. 將細(xì)胞重懸于200μl Binding Buffer。 6. 加入10μl Annexin V-FITC和10μl PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15分鐘 或4℃反應(yīng)30 分鐘。 7. 加入300μl Binding Buffer，在1小時(shí)內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。 8. 若用熒光顯微鏡檢測(cè)，將細(xì)胞混合液離心，取細(xì)胞沉淀涂片，再進(jìn)行觀察。

使用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的注意事項(xiàng)

為保證得到理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在使用此試劑盒之前請(qǐng)認(rèn)真閱讀該注意事項(xiàng)。

1.旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時(shí)液體灑落。

2.Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物質(zhì)，在保存與操作時(shí)請(qǐng)注意避光。

3.Propidium iodide（PI）能通過皮膚吸收，對(duì)眼睛有刺激作用。

4.在細(xì)胞洗滌的zui后一步，請(qǐng)盡量將上清棄凈，以免PBS殘留影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

 5.PI染色時(shí)間過長(zhǎng)有可能造成檢測(cè)的凋亡率偏高，建議首先進(jìn)行Annexin V-FITC染色，上機(jī)前5分鐘再加入PI染色。

6.整個(gè)操作過程動(dòng)作要盡量輕柔，勿用力吹打細(xì)胞，盡量在4℃下操作。

7.反應(yīng)完畢后請(qǐng)盡快檢測(cè)，因?yàn)榧?xì)胞凋亡是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，反應(yīng)1小時(shí)后熒光強(qiáng)度就開始衰變。

8.成功的檢測(cè)凋亡受以下幾種因素的影響，如細(xì)胞類型、細(xì)胞膜上PS的密度、發(fā)生凋亡時(shí)PS翻轉(zhuǎn)的比例、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法、所用試劑、誘導(dǎo)凋亡的時(shí)間等，把這些影響因素進(jìn)行優(yōu)化對(duì)實(shí)驗(yàn)成功是非常必要的。